這篇我們要學(xué)習(xí)的是美國俄勒岡州衛(wèi)生科學(xué)大學(xué)的Andrew Adey課題組開發(fā)的新型單細(xì)胞測序技術(shù)，SCI-seq,如何不需要用微流控和液滴分選就可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測序?這種新型的單細(xì)胞測序技術(shù)有何優(yōu)勢？
說起這種新的單細(xì)胞測序技術(shù)，需要先談到Tn5插入的index方法，什么意思那？
Tn5是一種轉(zhuǎn)座酶，可以將DNA片段插入到基因組中，因此可以利用Tn5，將想要的序列插入到基因組，并且可以將基因組打斷成相應(yīng)的片段，并且在末端鏈接上想要的序列，如果我們在末端鏈接的序列上，使用不同的序列，因此便可以進(jìn)行復(fù)雜的組合建庫微流控。
那什么叫復(fù)雜建庫那？
復(fù)雜建庫的方法就是將PCR index引入的時候，和Tn5 index引入的時候，進(jìn)行組合，從而可形成數(shù)十萬種不同的index，而每一個細(xì)胞將會得到index，這也就是復(fù)雜建庫的精髓所在。
那么如何將復(fù)雜建庫應(yīng)用在單細(xì)胞測序上哪？
其實(shí)兩年前，便有科學(xué)家們著手這方面的研究，通訊作者Jay也就是本期單細(xì)胞微流控HiC的通訊作者。
上圖也就是復(fù)雜建庫方法的精髓所在，需要先將細(xì)胞用FACS分選到96孔板中，讓每個孔有25個左右的細(xì)胞，然后不同孔之間使用不同的Tn5對應(yīng)的index，進(jìn)行插入整合。這個時候，每個孔內(nèi)細(xì)胞的index是一樣的，而且細(xì)胞是完整的微流控。
然后再對細(xì)胞進(jìn)行混合和重新分配，然后這樣，在新的96孔板里面，每個細(xì)胞的index是不一樣的，然后對每一個孔，裂解，加上PCR對應(yīng)的index，這樣就保證了每個細(xì)胞的index的微流控。
理解了這種index的復(fù)雜建庫方法進(jìn)行單細(xì)胞測序后，Jay在2014年這篇Science中開展的就是ATAC-seq，事實(shí)上，轉(zhuǎn)座酶對染色體的插入并非均一的，而是插入在活性區(qū)域，這樣便可以進(jìn)行活性區(qū)域的判斷。
然而，如果是想要單細(xì)胞DNA測序的話，這個便成了劣勢，顯然，如果有些區(qū)域無法插入，進(jìn)而就無法建庫，那么無法進(jìn)行DNA覆蓋。
因此科學(xué)家們構(gòu)思了一個非常巧妙的方法，第一種方案是通過鋰輔助的核小體去除的方法，第二種是通過SDS然后歐聯(lián)的方法。
通過這兩種方法，可以看到在上圖中，仍然保持細(xì)胞核的完整性。
然后用復(fù)雜建庫的方法，進(jìn)行測序，這個時候就可以獲得更加平均插入的Tn5，index。
從這張圖可以看到與標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行比對，LAND和xSDS兩種方法，可以具有更加均衡的插入建庫。
既然獲得了這種方法，下面需要做的便是評價方法的適用情況，是否可以進(jìn)行有效的基因組建庫？與其他方法相比如何？
科學(xué)家們對測序的序列，進(jìn)行分析，可以看到所有的細(xì)胞中，明顯的分為兩類，一類是具有重復(fù)序列很少，質(zhì)量比較高，一類重復(fù)序列很多。顯然前者更適合用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。
那么是否真的是單細(xì)胞分析那？
科學(xué)家們將小鼠和人的細(xì)胞進(jìn)行混合，這樣，如果測到的細(xì)胞有小鼠和人細(xì)胞混合的reads，那么提示并非實(shí)驗(yàn)所獲得的單細(xì)胞。不過這一類數(shù)據(jù)很少，提示確實(shí)是微流控單細(xì)胞數(shù)據(jù)。
那么測序數(shù)據(jù)的覆蓋度如何那？
MAD和MAPD可以用于評價不同測序方法覆蓋度的水平，分?jǐn)?shù)越低越好，可以看到在兩種評價標(biāo)準(zhǔn)中LAND都比xSDS差。
SCI-seq顯著的應(yīng)用便是用于基因組拷貝數(shù)情況的分析；針對于不同核型的細(xì)胞，科學(xué)家們對不同的方法進(jìn)行分析：可以看到過濾后的數(shù)據(jù)而言，xSDS已經(jīng)和DOP和QRP相差無幾。
科學(xué)家們將這種微流控方法，應(yīng)用于恒河猴的大腦染色體拷貝數(shù)分析，和癌癥單細(xì)胞拷貝數(shù)分析：
可以預(yù)見在不遠(yuǎn)的將來單細(xì)胞測序的費(fèi)用越來越低，將成為人們解析更高層次的生命活動的基本手段。
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